EINLEITUNG

Im Rahmen unseres Pluskurses Mikrobiologie entstand die Idee dieser Jugend-forscht-Arbeit. Aus der Reihe unserer Versuche wollen wir die Versuche präsentieren, bei denen wir die markantesten Ergebnisse erzielen konnten. Die vorliegende Jugend-forscht-Arbeit behandelt das Thema:

EINFLUß VON UMWELTFAKTOREN AUF DAS WACHSTUM VON MIKROORGANISMEN UNTER BESONDERER BERÜCKSICHTIGUNG VON HEMMSTOFFEN

Zu Versuchszwecken haben wir aus Weiden-, Eichenrinde und Tee Extrakte mit den spezifischen Gerbstoffen gewonnen und deren Hemmwirkung, im Vergleich zu den reinen Gerbstoffen, an unseren Mikroorganismen erprobt.

MATERIAL UND METHODEN

NÄHRBÖDEN
Verwendung fanden:
a) Standard I Agar Nährböden
b) Malzextraktagarnährböden
c) Gelatineröhrchen
Verwendete Stoffe:
a) Standard I 11,1g Fa.---------
Aqua dest. ad 300ml
pH 7,5
b) Malzextrakt 14,4g Fa.---------
Agar-agar ca.1,7%
Aqua dest. ad 300ml
pH 5,5
c) Gelatine 30g
aqua dest. ad 300ml
pH 7,0
Herstellungsverfahren:
Die Stoffe aus a), b) bzw. c) werden vermengt und mit einem Autoklaven (20 Minuten bei 125oC und 1,25bar Druck) sterilisiert. Anschließend werden Standard I und Malzextraktagar in Petrischalen gegossen, wo sie erstarren. Die Gelatinelösung wird in Reagenzgläser gefüllt, wo sie ebenfalls erstarrt. Da sie bei Raumtemperatur bereits flüßig ist, muß sie vor der Auswertung gekühlt werden.

AUFZUCHT VON BAKTERIEN- BZW. PILZKULTUREN

1. Bakterienkulturen
Mit einer, durch Rotglut sterilisierten, Platinimpföse wird ein wenig Bakterienmaterial aus der Stammkultur entnommen und in Schlangenlinien ausgestrichen. Anschließend wird die Öse wieder desinfiziert. Diese Abläufe finden an einem vorher mit Alkohol desinfizierten Arbeitsplatz, in der Nähe einer Flamme statt. Man bebrütet die Kultur bei ca. 25oC. Verwendete Organismen waren: Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Cellulomonas spec.
2. Pilzkulturen
Da jeder Teil der Pilzhyphen potentiell wachstumsfähig ist, genügt es, ein Stück Boden- oder Luftmycel der Stammkultur steril auf den Nährboden zu übertragen. Dies kann, wie bei der Überimpfung von Bakterienkulturen, mit Übertragung von Sporen mittels rotglutsterilisierter Impföse oder durch Übertragung von entnommenen Lufthyphenmaterial geschehen. Diese Abläufe finden an einem vorher mit Alkohol desinfizierten Arbeitsplatz, in der Nähe einer Flamme statt. Akzeptable Wachstumsbedingungen erreicht man bei Raumtemperatur. Verwendete Organismen waren: Phycomyces blakesleeanus, Fusarium spec., Penicillium roqueforti.
3. Beimpfen von Gelatineröhrchen:
Mit einer durch Rotglut sterilisierten Platinimpfnadel wird etwas Material aus der Stammkultur entnommen. Nachdem der Verschluß des Gelatineröhrchens entfernt und der Hals abgeflammt wurde, wird die Gelatine durch einen tiefen Stich beimpft. Nach wiederholtem Abflammen des Reagenzglashalses wird das Röhrchen verschlossen und bebrütet. Verwendet wurden Organismen aus Fließwasserkulturen.
4. Vorsichtsmaßnahmen
Die Bebrütungstemperatur liegt zwischen 20oC und 22oC (Raumtemperatur). Dadurch werden eventuell auftretende pathogene Luftkeime, die ihr Wachstumsoptimum bei 360C bis 38oC (Körpertemperatur) erreichen, im Wachstum gehemmt. Des weiteren werden bei uns im Labor nur Mikroorganismen verwendet, die für den Menschen absolut ungefährlich sind (Mikroorganismen der Risikogruppe 1 nach dem Merkblatt B 006 und B 007 der Berufsgenossenschaft der chemischen Industrie). Zusätzlich sind alle Mitarbeiter des Labors angewiesen, die Kulturen zu behandeln, als seien sie pathogen. Dies beugt zusätzlich einer Verunreinigung des Labors z.B. durch Sporen vor.

CHROMATOGRAPHIE (PAPIER -, DÜNNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE)

In eine, mit Laufmitteldampf gesättigte Chromatographiekammer wird das zu entwickelnde Chromatogramm gestellt. Erreicht das, durch Kapillarkräfte aufgestiegene Laufmittel das Endniveau, wird die Laufmittelfront mit Bleistift gekennzeichnet und das Chromatogramm zum Trocknen aufgehängt. Entwickelt wird das trockene Chromatogramm mit Eisen(III)chloridlösung (Sprühentwicklung für Phenole). Eine weitere Möglichkeit der Entwicklung besteht in der Bestrahlung durch UV-Licht, wobei man Fluoreszenz- und Absorbtionszonen markiert. Hergestellt werden die Chromatogramme durch punktförmiges Auftragen der Lösung der aufzutrennenden Substanzen mittels einer Pipette auf eine definierte Startlinie.
1. Laufmittel (für Phenole):
(1)-Butanol (CH3(CH2)2CH2OH) 24ml
Eisessig 99-100% (CH3COOH) 6ml
Aqua dest. 6ml
2. Laufmittel (für Phenole) nach F. Cramer
(1)-Butanol (CH3(CH2)2CH2OH) 40ml
Eisessig 99-100% (CH3COOH) 10ml
Aqua dest. 50ml
Man trennt die organische Phase ab und gibt zu 50ml dieser Phase 5ml Glycol.
HERSTELLUNG DER EXTRAKTE
1. Rindenextrakte
3g Rinde wurden, mit destilliertem Wasser bzw. Methanol, unter Verwendung eines Mörsers zerkleinert. Durch 5-10 minütiges schonendes Einkochen wird ein Sud hergestellt. Dieser ergab abfiltriert das zu untersuchende Substrat. Verwendung fanden Rinde der Salweide (Salix caprea L.) und Rinde einer Steineiche (-----).

2. Moosextrakte
0,1g Moos wird mit einem Mörser zerkleinert, im Homogenisator mit 500?l Lösungsmittel (Aqua dest. bzw. Hexan) mazeriert und in einem Wasserbad ca. 10 min schonend teilweise eingedampft (ca. 800C). Das Filtrat wird mit reinem Lösungsmittel auf 1000ml ergänzt. Verwendung fanden das Haarmützenmoos und ein Bärlappgewächs (Lycopodium spec.). Die Versuche wurden wie folgt, nach ihre Bearbeitung benannt.
Haarmützenmoos: Haar / Hex Homo+Mö Haar / Hex Homo
Haar / H2O Homo+Mö Haar / H2O Homo
Bärlappgewächs: entsprechend

3. Teextrakte
In einem Homogenisator werden 0,1g des Tees in 1000?l des Lösungsmittels mazeriert; anschließend filtriert man. Verwendete Tees: Brennesselblättertee2 und Schafgarbenkrauttee . Als Lösungsmittel wurden n-Hexan und Aqua dest. verwendet. Die Versuchsansätze wurden wie folgt benannt:
Brennesselblättertee: Br./H2O Br./Hex
Schafgarbenkrauttee: S. / H2O S. /Hex
Mischungen: Br.+S./ H2O Br.+S./Hex

ARBEITSTECHNIKEN

1. Sterile Testplättchen
Aus Papierchromatographiepapier stanzten wir mit einem gewöhnlichen Locher kreisrunde Plättchen. Für eingehendere Versuche schnitten wir Chromatographiepapierstreifen (3cm x 0,5cm, Fassungsvermögen ca. 15µl) aus. Die Testplättchen wurden mit dem Autoklaven sterilisiert.

2. Sterile Tränkung der Testplättchen
Um die zu testende Lösung auf die Testplättchen aufzutragen, werden zuerst Pipettenspitzen autoklaviert. Währenddessen werden nahe einer Flamme die Testplättchen auf den Nährboden aufgelegt. Mit der, mit autoklavierten Pipettenspitzen bestückten, Pipette wird eine definierte Menge Testlösung entnommen (zumeist 20?l) und langsam auf die Testplättchen aufgetropft. Hierbei war wiederum darauf zu achten nahe einer Flamme zu arbeiten.

3. Besondere Ausstrichformen
Um die Hemmwirkung der zu testenden Substanzen bestimmen zu können, wurden zwei Ausstrichverfahren verwendet:
a.) Die Mikroorganismen werden schlangenlinienförmig ausgestrichen. D iese Ausstrichvariante bietet die Möglichkeit mehrere Substanzen in kleinster Menge und größter Konzentration auf deren Wirksamkeit zu testen, indem man sie auf sterile Locherplättchen in den Schlangenlinienschlaufen auftropft. So können mehrere Substanzen zum Vergleich auf einer Platte getestet werden .
b.) Die Mikroorganismen werden in geraden Linien, von den länglichen Plättchen weg, ausgestrichen. Durch Messung des entstandenen Hemmhofs (Abstand von Plättchen zur angewachsenen Bakterienkultur), kann man Aussagen über den Wirkungsgrad der Testflüssigkeit machen . Hierbei entstanden Probleme bei der gleichmäßigen Durchtränkung der Testplättchen.
c.) Das „Tic-tac-toe“-System . Es wird so ausgestrichen, daß sich die zwei Parallelenpaare orthogonal schneiden. Dies führt zu vier Schnittpunkten, auf die jeweils ein Testblättchen aufgelegt wird. Dadurch kann man in vier Richtungen den Hemmhofdurchmesser messen.
AUSWERTUNG DER VERSUCHE
1. Versuche zu abiotischen Faktoren
Abiotische Umweltfaktoren lassen sich in Boden- und Klimafaktoren einteilen:
1.) Beispiel für Klimafaktoren
Einfluß von Temperatur
Phycomyces wird bei wechslnden Temperaturbedingungen im Brutschrank aufgezogen.Fünf Tage wird die Kultur bei dreißig Grad Celsius bebrütet, dann zwei Tage bei Raumtemperatur stehengelassen, danach zwei Tage bei dreißig Grad berütet und anschließend einen Tag in den Kühlschrank gestellt (ca. 4oC). Diese Temperaturunterschiede zeigen sich im unterschiedlich dichten Wachstum der Boden- und Lufthyphen. Hält man die Platte gegen das Licht, sind diese Unregelmaßigkeiten in hellen und dunklen Kreisen zu erkennen.
2.) Beispiele für Bodenfaktoren
Einfluß des pH-Werts des Nährbodens
Für diesen Versuch wurden, zusätzlich zu dem normalen Nährboden mit pH 5,0 , Nährboden mit pH 7,0 und 9,0 hergestellt. Bei Fusarium spec. und Penicillium roqueforti wuchsen die Kolonien auf basischerem Boden schlechter wie auf dem Standardmalzagarnährboden. Die Kolonien von Penicilium roqueforti wuchsen vereinzelter, einzelne Kolonien sind zu erkennen . Fusarium spec. Bildete weniger Luftmycel , dieses wuchs nicht wie gewohnt bauschig sondern die Mycelien verklumpten .Phycomyces blakeleanes hingegen gedieh auf dem Nährboden mit pH 9,0 am besten ,je saurer der Boden desto weniger regelmäßig wurde das Luftmycel ausgebildet. Auffällig war, daß sich bei dem Nährboden mit pH 9,0 bei Bewuchs mit Phycomyces mehr Kondenzwasser bildete als bei pH 7,0. Bei pH 5,0 war kein kondenzwasser zu beobachten .

Isolation von proteolytischen Mikroorganismen aus Fließwasserproben
Eine durch Rotglut sterilisierte Platinimpfnadel wird mit dem Probenwasser benetzt. Nach dem der Verschluß des Gelantineröhrchens entfernt und der Hals abgeflammt wurde, wird die Gelantine durch einen tiefen Stich beimpft. Nach wiederhohltem Abflammen des Reagenzglashalses wird das Rörchen verschloßen und bebrühtet.
Entnahmeort der Fließwasserproben aus der Amper :
Amper 1: Emmering, Höhe Alter Wirt, Neuer Friedhof
Amper 2:-------------------------------------------------------
Amper 3: Höhe Kläranlage, ohne Vorfluter
Zu jedem Röhrchen wird ein Parallelansatz angefertigt. Die Versuche werden wie folgt benannt:
Amper 1: Röhrchen N0 1 1/1 und 1/2
Amper 2: Röhrchen N0 2 2/1 und 2/2
Amper 3: Röhrchen N0 3 3/1 und 3/2
Als Ergebnis ergab sich :
1/1 2,0 cm 1/2 1,0 cm ? 1,5 cm
2/1 0,8 cm 2/2 1,3 cm ? 1,1 cm
3/1 2,5 cm 3/2 2,5 cm ? 2,5 cm
Nahe des Klärwerks läßt sich ein deutlicher Anstieg der Population an proteolytischen Mikroorganismen feststellen. Dies deutet auf eine erhöhte Proteinkonzentration (z.B. durch organische Abfallprodukte) hin.

Einfluß von den Gerbstoffen Thymol und Salicylsäure
Hyphenmaterial der Pilze Phycomyces blakesleeanus und Penicillium roqueforti wird steril in Schlangenlinien ausgestrichen. An das eine Ende der Ausstrichlinie werden 10 ?l Thymol und an das andere Ende 10 ?l Salicylsäure (C6H4(COOH)(OH)[1,2]-Lösung) aufgetragen (jeweils 10 mg/ml).Die Platte, die mit dem Penicillium beimpft wurde, zeigt nach einer Woche einen kleinen Hemmhof beiThymol (? 0,5 cm) und einen großen Hemmhof (? 1,5 cm) bei Salicylsäure. DiePhycomyces-Platte zeigt genau den gegensätzlichen Effekt: Phycomyces wird von Thymol stark gehemmt (? 4,5 cm), jedoch Salicylsäure zeigt kaum Wirkung (? 0,5 cm). Bei lichtmikroskopischer Untersuchung des verändert aussehenden Bodenmycels, nahe des Hemmhofs ,waren keine Veränderungen zu erkennen.
Einfluß von Tanin, Gallussäure und Salizylsäure
Verwendet wurde jeweils eine Konzentration von 10mg/ml. Als optimale Lösungsmitte
erwiesen sich für Salicyl- und Gallussäure Methanol und für Tanin Aqua dest.. Totalhemmung ergab sich mit Schlangenlinienverfahren (Verfahren a.))bei Micrococcus lut., wo wir die Testsubstanzen an drei Punkten mit den sterilen Locherplättchen auftrugen. Der anscheinend robustere Bacillus subt. Wurde durch Salizylsäure wurde gehemmt; Tanin und Gallussäure Konnzen nur eine Ausdünnung des Bewuchses hervorrufen.
Um für M. lut. auch quantifizierbare Ergebnisse zu erhalten, legten wir eine Verdünnungsreihe der Lösungen an. In folgenden Konzentrationen wurden dieLösungen hergestellt: 0,2 g/ml, 0,1 g/ml (Stammlösung), 0,05 g/ml (1:2), 0.001 g/ml (1:10).
Lösung Organismus Konz.: 0,2 Stamm 1:2 1:10
Salizylsäure: M. lut. 1,0cm 0,8cm 0,65cm 0,5cm
B. subt total 0,65cm 0,6cm 0,6cm
Gallussäure: M. lut. Totalhemmung: Diffusionsradius (0,2) 2,5 cm
B. subt Totalhemmung: (siehe oben)
Tanin: M. lut. Keine Hemmung: (siehe unten)
B. subt 0,6 cm keine Ergebnisse
Bemerkenswert ist, daß M. lut. anscheinend seine Pigmentierung verliert. Er wechseltseine Farbe von gelb nach weiß. Mehrere andere Taninansätze brachten das selbe Ergebnis.

2. Biotische Umweltfaktoren

Aus dem Bereich der Moose untersuchten wir einen Lycopodium spec. (Bärlappgewächs) und das ----------- (Haarmützenmoos). Auf M. lut. wirkten nur Bär / Hex Homo+Mö und Haar / Hex Homo+Mö, allerdings nur in sehr bescheidenen Ausmaßen. Auf B. subt. wirkten ausschließlich Haar / Hex Homo+Mö und Haar / Hex Homo, Ihrer Konzentration entsprechend, stark.

Von einer gefällten, alten Eiche (ca. 100 Jahre) stammt das verwendete Stück, von dem wir 3,0 g mit 10 ml Aqua dest. in einem Mörser mazerierten. Die Lösung wurde auf eine Platte nach Verfahren b.) ausgestrichen. Daraus ergaben sich folgende Ergebnmisse: Bei B. subt. war keine Hemmung zu beobachten, M. lut. wurde auf einer durschnittlichen Strecke von 1,8 cm gehemmt. Um die in der Eichenrinde enthaltenen Hemmstoffe zu konzentrieren, da die Stammlösung im Papierchromatogramm keine erkennbare Phenollinien aufwies, verwendeten wir Folgendes Verfahren:
Zu 1,0 g Eichenrinde gaben wir 10,0 ml Methanol. Nach 10 Minuten des Einkochens im Wasserbad bei ca.50-600C läßt man den Sud bei Raumtemperatur 15 min einwirken. Nach dem Abfiltrieren gießt man den Rückstand ad 10,0ml Methanol auf. In einen Scheidetrichter mit 10,0 ml Äther (C2H5OC2H5) und 30,0 ml Aqua dest.wird die Lösung zum Ausschütteln gegeben. Mit dem Rotationsverdampfer rotiert man die wässrige Phase ein.
Leider war trotzdem bloß am Grundfleck des Papierchromatogramms eine Eisen(III)chlorid-Reaktion zu finden.

Anders verhielt es sich mit Weidenrinde. Wir beobachteten über ein Jahr lang eine Salix caprea (Salweide).Im Vergleich der Ansätze des Frühjahrs, des Sommers, des Herbstes und des Winters konnten nur minimale Unterschiede im Bereich von einem Millimeter festgestellt werden, die sich sowohl auf Konzentrationsänderungen, als auch auf Messungenauigkeiten zurückführen lassen.
Allgemein konnten nur sehr schwache Hemmwirkungen erziehlt werden.Trotzdem ließen wir die Lösungen laufen und fanden deutlichePhenollinien.

Weitere markante Ergebnisse erzielten wir mit verschiedenen Teesorten. Brennesselblättertee und Scharfgarbentee erzielten sowohl in n-Hexan-Lösung als auch in Aqua-dest.-Lösung alleine keine Hemmwirkung. Nur in Kombination in n-Hexan-Lösung hatten sie eine beachtliche Wirkung auf B. subt., in wässriger Lösung dagegen auf M. lut..

Drei Jahre vor Beginn dieser Jugend-foscht-Arbeit bauten wir mit unserem Lehrer unser Schullabor auf und wurden als erste Schüler unseres Gymnasiums in die Künste der Mikrobiologie eingewiesen. In den folgenden Jahren besuchten wir den locker und humorvoll gestallteten Pluskurs Mikrobiologie. Der Spaß an diesem speziellen Fachgebiet und das allgemeine Interesse an der Chemie ( zwei von uns besuchen den Leistungskurs Chemie) und der Biologie (unser Dritter besucht in diesem Fach den Leistungskurs) führten schlußendlich zu dieser Arbeit. In groben Zügen umfaßt sie die Versuche und Experimente der letzten zwei Jahre und deren interessanteste Ergebnisse, die hiermit veröffentlicht werden. Wir wollen noch einmal allen danken die diese Arbeit unterstützt haben, doch vor allem unserem Lehrer, ohne dessen Engagement, welches man heutzutage viel zu selten findet, dies alles nicht möglich gewesen wäre. Ihm sei diese Jugend-forscht-Arbeit gewidmet.